Les neurones rétiniens fabriqués à partir de cellules souches réussissent le grand test : ils forment eux-mêmes des synapses

À mesure que nous, les mammifères, vieillissons, beaucoup d’entre nous commencent à perdre la vue parce que les neurones de notre rétine dégénèrent. Nos cellules ganglionnaires rétiniennes peuvent être attaquées par le glaucome, ou nos bâtonnets et cônes (photorécepteurs) peuvent être affectés par la dégénérescence maculaire ou la rétinite pigmentaire. Quelque part au cours de l’évolution, nous avons perdu notre capacité à régénérer ces types de cellules, tout comme nous avons perdu la capacité à régénérer les membres. Une fois qu’ils sont partis, ils sont partis.

Mais nous, les humains, avons très bien développé d’autres choses : la capacité d’utiliser la raison et le désir de subvenir à nos besoins. Et ces traits nous ont mis sur le point de compenser certaines de nos lacunes évolutives.

C’est assez étonnant que nous pouvons maintenant cultiver des cellules souches humaines en « organoïdes » rétiniens – de petites boules contenir tous les différents types de cellules nécessaires pour faire fonctionner une rétine même organisée dans les bonnes couches.

Mais maintenant, nous avons appris que si nous décomposons l’organoïde en cellules individuelles, ces cellules sont capables de former spontanément des composés communicants (synapses) avec d’autres cellules rétiniennes. Cela signifie qu’un patient peut développer ses propres cellules souches dans des cellules rétiniennes et les appliquer à sa propre rétine, ces nouvelles cellules peuvent remplacer fonctionnellement les anciennes et la vision peut être restaurée. Aucune thérapie génique requise, merci beaucoup.

Vous pouvez tout lire sur ce dernier obstacle conquis dans les laboratoires de l’Université du Wisconsin des Drs. David Gamm et Entre Xinyu Zhao le numéro du 4 janvier du Procédures de l’Académie nationale des sciences.

L’année dernière, le laboratoire de Gamm montré que les bâtonnets et les cônes (photorécepteurs) fabriqués à partir de cellules souches peuvent réagir à la lumière, tout comme les cellules saines. C’est un excellent développement pour fabriquer des cellules individuelles pour la thérapie, mais pour faire partie d’une rétine fonctionnelle, ces bâtonnets et cônes doivent être capables de transmettre leurs signaux au reste de la rétine. Cela se produit via les synapses, des connexions ultra-minces entre les neurones à travers lesquelles les molécules de signalisation (principalement du glutamate) ont réussi:

Les organoïdes rétiniens (RO) ont donné à Gamm et Zhao l’espoir que les parties défectueuses d’une rétine pourraient vraiment être reconstruites à partir de cellules souches, car non seulement toutes les cellules RO forment les couches qu’elles devraient, mais elles aussi créer des liens les uns avec les autres dans le RO avec des synapses. Vous pouvez voir à quel point la structure d’un RO est similaire à une vraie rétine en termes de types de cellules et de synapses (peintes en vert) :

Donc la question est, si nous cassons ces cellules RO et appliquons les bonnes sur la rétine du patient, seront-elles capables de recréer ces connexions synapsiques ? C’est ce que les laboratoires de Gamm et Zhao ont voulu tester ici.

Ils ont rompu certains RO avec de la papaïne, une enzyme de la papaye qui est utilisée comme attendrisseur de viande et aide à la digestion, mais qui est également utilisée connu détruire les synapses. (Alors n’injectez pas de papaïne directement dans vos globes oculaires, d’accord ?)

Après le traitement à la papaïne, ils ont constaté que les protéines importantes pour le fonctionnement des synapses étaient heureusement toujours présentes, mais qu’elles avaient plus ou moins reculé dans les cellules. Il semblait donc que les cellules auraient de bonnes chances de rétablir des synapses entre elles si seulement elles pouvaient retrouver leur chemin.

Ils ont cultivé ces cellules RO ensemble en tant qu’individus sur une plaque pendant 20 jours, dans une situation similaire à celle qu’ils rencontreraient lorsqu’ils seraient appliqués sur une vraie rétine. Mais comment savoir si les neurones ont formé ces petites synapses et si ces synapses fonctionnent ?

Heureusement, il existe un moyen astucieux de le faire appelé « traçage synaptique ». Il s’avère que le virus de la rage peut être transféré entre les neurones seul en faisant fonctionner les synapses, nous pouvons donc l’utiliser pour savoir non seulement si les synapses sont présentes, mais aussi dans quelle mesure elles fonctionnent. (Cela semble être le bon moment pour ajouter le virus de la rage à la liste très longue mais toujours croissante de choses à ne pas injecter dans vos globes oculaires.)

La façon dont cela est fait est vraiment cool, et restez avec moi, car à la fin, vous obtenez des photos colorées qui montrent assez clairement ce qui s’est passé.

Tout d’abord, nous devons nous assurer que le virus de la rage n’infecte qu’un petit pourcentage de nos cellules sans ravager toute la culture, et nous devons également étiqueter ces cellules comme des « starters » d’une manière ou d’une autre. Nous devons donc d’abord faire une petite configuration.

Nous commençons avec un autre virus – le lentivirus – dans lequel nous avons mis un gène pour la protéine fluorescente verte (GFP) que nous avons ciblé sur le noyau. Nous pourrons alors voir toutes les cellules infectées par notre lentivirus car elles ont un gros point vert au milieu. Nous pouvons faire quelques essais et erreurs avec la quantité de lentivirus que nous utilisons afin qu’environ 5 % de nos cellules soient infectées.

Nous mettrons deux autres gènes dans notre lentivirus, appelés TVA et Rgp, et nous comprendrons dans un instant pourquoi ces deux sont importants.

Ensuite, nous allons infecter nos cellules avec le virus de la rage, mais nous allons changer le gène de la protéine d’enveloppe. Habituellement, c’est Rgp, mais nous allons le remplacer par un autre appelé Env. Les virus qui utilisent Env comme protéines d’enveloppe ne peuvent infecter que les cellules qui ont TVA, c’est exactement pourquoi nous venons de mettre TVA dans nos cellules à point vert. Maintenant, nous pouvons libérer le virus de la rage dans la culture, et il n’infecte que les cellules du point vert.

Nous avons mis un gène pour mCherry (une protéine fluorescente rouge) dans notre virus de la rage afin que toutes les cellules infectées aient une couleur rouge partout dans la cellule et qu’il soit facile d’identifier les cellules infectées par la rage. Ainsi, nos « cellules starter » avec le point vert seront toutes infectées par la rage parce qu’elles ont toutes TVA, et cela rendra nos « cellules starter » rouge et verte festives.

Rappelons que nous avions également mis le gène Rgp dans notre lentivirus, donc nos cellules à point vert fabriquent également la protéine Rgp. Une fois que le virus de la rage infecte nos cellules avec le point vert, elles retrouvent leur protéine d’enveloppe d’origine, retournent à leur ancien moi et… ohhhhhhh.

Alors maintenant, environ 5 % de nos cellules sont des « cellules de départ » rouges et vertes, et elles peuvent infecter d’autres cellules de la culture avec la rage (et les rendre rouges) seulement s’ils sont reliés à d’autres cellules par des synapses fonctionnelles ! Si cela se produit, nous devrions voir des globules rouges sans point vert, c’est-à-dire des cellules infectées par la rage qui n’étaient pas des cellules starter. Bam ! Voilà votre visualisation, et maintenant allons-y…

Une bonne vérification pour commencer est l’ensemble du système dont nous venons de parler, mais pas de RGP dans le lentivirus. Cela signifie que les cellules starter ne devraient pas pouvoir infecter d’autres cellules, car la rage n’a pas sa protéine d’enveloppe normale. Tout ce que nous devrions voir, ce sont des cellules de départ, colorées en rouge et vert.

Ainsi, la petite image en bas à gauche montre des cellules starter rouge-vert qui ne peuvent pas infecter d’autres cellules, même s’il y a des synapses actives. Les photos plus bleues à gauche ont une tache supplémentaire appelée DAPI, qui détecte l’ADN avec une couleur bleue afin que chaque cellule apparaisse bleue. De cette façon, vous pouvez visualiser le pourcentage de cellules infectées en tant que cellules starter. Ensuite, nous supprimons le DAPI bleu sur le côté droit afin que vous ne voyiez que le rouge et le vert. Notez que tous ceux qui sont rouges ont aussi un point vert.

Bon maintenant, faisons le vrai test où Rgp est incorporé dans le lentivirus afin que le virus de la rage puisse maintenant infecter d’autres cellules mais uniquement par des synapses actives. Même chose pour les couleurs, et maintenant on espère voir des neurones rouges :

Nous voyons beaucoup d’infections par la rage des cellules non-démarrantes, ce qui signifie que nous avons des synapses actives ! Et cela signifie que nous sommes vers les essais cliniques!

« Nous avons piqué cette histoire ensemble dans le laboratoire, pièce par pièce, pour renforcer la confiance que nous allons dans la bonne direction », a déclaré Gamm, qui a breveté les organoïdes et co-fondé Opsis Therapeutics, basé à Madison. adapter la technologie pour traiter les affections oculaires humaines sur la base des découvertes d’UW-Madison. « Tout cela mène finalement à des essais cliniques sur l’homme, qui sont clairement la prochaine étape. »

Après avoir confirmé la présence de connexions synaptiques, les chercheurs ont analysé les cellules impliquées et ont découvert que les types de cellules rétiniennes les plus courants qui forment les synapses étaient les photorécepteurs – bâtonnets et cônes – qui sont également perdus dans des maladies telles que la rétinite pigmentaire et la macula maculaire liée à l’âge. dégénérescence. comme dans certaines lésions oculaires. Le deuxième type de cellule le plus courant, les cellules ganglionnaires rétiniennes, est dégénéré dans les troubles du nerf optique tels que le glaucome.

« Ce fut une révélation majeure pour nous », déclare Gamm. « Cela montre vraiment l’impact potentiellement large que ces organoïdes rétiniens peuvent avoir. »